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1、故事发生在2004年，即《生化危机2》六年后，由于各新闻媒体争相报导安布雷拉公司在莱肯市的地下研究所，制作的T-病毒早前泄漏导致陷入生化的危机。连串的负面新闻导致公司股票价格笔直暴跌。美国联邦政府在各国政府的压力下暂停安布雷拉公司的业务，其后公司便宣告破产，所有地下研究中断，T-病毒的传播得以停止。

2、这次的主角是在《生化危机2》中到莱肯市的警察，现为美国总统直接统率的最高机密组织成员的里昂·斯科特·肯尼迪。里昂今次被派遣到欧洲某个（推测为西班牙或苏格兰）神秘村庄，受命拯救格林汉姆总统被拐去的女儿阿什莉·格林汉姆（Ashley Graham）。在拯救的途中他发现阿什莉的绑架者是一个神秘的宗教团体，名叫“Los Illuminados”（西班牙语：照亮的道路。勿与Illuminati混淆），教主是奥斯穆德·萨德勒（Osmund Saddler）。

3、进入村庄后在村庄的房间救出了一个神秘男子路易斯·赛拉（Luis Sera），就是这个时候村长比特罗斯·门德斯（Bitores Mendes）出现，里昂跟村长交手可谓不堪一击，里昂及路易斯都被击晕了。同时，奥斯穆德出现，并且在里昂身上注射了寄生体“Las Plagas”。里昂醒过来的时候在山谷的另一边，从路易斯口中得知阿什莉正在被关在村内的教堂 他跟路易斯避开村民的袭击后，路易斯便独自逃去。里昂回到村庄的教堂救出了阿什莉，并且利用强大武器击倒了村长，于是离开神秘村庄，一心等待美国联邦政府派来的直升机，但是大量村民赶到，于是里昂带着阿什莉进了一座古堡。

4、里昂跟阿什莉遇上了堡主雷蒙·萨拉查（Ramon Salazar），堡主在地下矿场利用村民发掘寄生体Las Plagas并且供给Los Illuminados。在这期间，路易斯找到了能够协助里昂及阿什莉解开身上的寄生体的药物及寄生体样本，原来他曾经是Los Illuminados的研究员，然而奥斯穆德·萨德勒却在关键时刻出现夺走了样本，并把路易斯杀害。其后里昂重遇了艾达·王，他在《生化危机2》后已经得知艾达是威斯克（Albert Wesker）派来的间谍，所以他对艾达的再次出现充满怀疑，但被艾达逃去。里昂始终很关心这个埋藏在心中的女子。艾什莉被萨拉查捉了及送到遥远的有军事设施后，里昂击倒了萨拉查后再次遇上艾达，艾达询问英俊的里昂需不需要送他一程，里昂以尴尬的表情回答。

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